MED | LHS杜洋團(tuán)隊(duì)在Nature Communications揭示人體孤兒受體GPR88激活和別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制
G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）是人類(lèi)基因組中最大的膜信號(hào)蛋白家族，包含800多個(gè)成員[1]。然而其中大約140個(gè)受體的內(nèi)源性配體仍然未被確定[2,3]。這些孤兒受體（orphan GPCR，oGPCR）的配體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理尚不明確，例如自激活機(jī)制。因此，為oGPCR“脫孤”以及解析它們的結(jié)構(gòu)能夠幫助研究者進(jìn)一步了解GPCR的分子機(jī)理，為相關(guān)疾病的藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)新的思路。
GPR88隸屬于A(yíng)類(lèi)GPCR，在大腦（特別是紋狀體）中特異性表達(dá)[2,3,5]。該受體能夠調(diào)節(jié)GABA和谷氨酸信號(hào)通路，以及包括多巴胺受體和阿片類(lèi)受體等一些其他的GPCR活性[6,7]。轉(zhuǎn)錄分析和小鼠敲除研究表明，GPR88在調(diào)節(jié)大腦和行為功能（例如認(rèn)知，情緒，基于獎(jiǎng)勵(lì)的學(xué)習(xí)和運(yùn)動(dòng)控制）中起著重要作用[6, 8, 9]。因此，GPR88是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾?。òň穹至寻Y，帕金森氏病，躁郁癥，焦慮，抑郁癥和成癮）的潛在藥物靶標(biāo)[2, 3, 10]。
近日，香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院、科比爾卡創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)研究院杜洋教授、柳正教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)Peter Gmeiner教授團(tuán)隊(duì)和日本東北大學(xué)Asuka Inoue教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際一流科學(xué)期刊Nature Communication雜志發(fā)表了題為“Activation and allosteric regulation of the orphan GPR88-Gi1 signaling complex”的最新研究成果。該研究基于冷凍電鏡技術(shù)解析了人類(lèi)GPR88-Gi1和合成激動(dòng)劑(1R，2R)-2-PCCA信號(hào)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，表明了(1R，2R)-2-PCCA結(jié)合在由跨膜螺旋5、6的細(xì)胞質(zhì)末端和Gi1的α5螺旋C末端組成的變構(gòu)位點(diǎn)，展示了正構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的電子密度代表未知的內(nèi)源性配體。MD和突變研究揭示了一組獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和水介導(dǎo)的極性網(wǎng)絡(luò)的GPR88的獨(dú)特激活機(jī)制，為理解GPR88的配體結(jié)合、激活和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制提供了一個(gè)結(jié)構(gòu)框架，并將促進(jìn)神經(jīng)精神疾病的創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)以及該受體的“脫孤”。香港中文大學(xué)（深圳）為第一作者單位，杜洋教授為該研究最后通訊作者。陳耕博士、徐俊博士、Maximilian Schmidt和Asuka Inoue并列第一作者。
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在結(jié)合或不結(jié)合2-PCCA的情況下，研究者將GPR88-Gi1復(fù)合物與scFv16（用于穩(wěn)定Gi的抗體）組裝在一起，獲得了兩個(gè)復(fù)合物在2.4 ?和3.0??分辨率下的cryo-EM密度圖，并藉此重建了原子結(jié)構(gòu)模型（圖1）。受體的N端，C端，細(xì)胞內(nèi)環(huán)3（ICL3），細(xì)胞外環(huán)1（ECL1）和細(xì)胞外環(huán)2（ECL2）的電子密度有所缺失，表明這些區(qū)域較為靈活和無(wú)序。與近期解析的GPR52不同，GPR88的ECL2沒(méi)有良好折疊并扮演自激活的激動(dòng)劑[4]，正構(gòu)位點(diǎn)未確認(rèn)的密度表明其可能擁有獨(dú)特的自激活機(jī)制。2-PCCA則結(jié)合在變構(gòu)位點(diǎn)，其周邊推測(cè)存在三個(gè)膽固醇分子。
圖1 GPR88-Gi1冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
GPR88的正構(gòu)位點(diǎn)由TM3、TM4、TM5、TM7和ECL2的一部分組成，在A(yíng)類(lèi)GPCR中較為保守。對(duì)該口袋的表面靜電勢(shì)分析表明，TM3、TM4和TM5產(chǎn)生了一個(gè)長(zhǎng)的疏水孔，同時(shí)細(xì)胞外表面帶電并且親水（圖2）。結(jié)合兩極化的口袋特征和位于口袋中電子密度的形狀，作者推測(cè)該電子密度代表了一種脂質(zhì)分子，扮演內(nèi)源性配體的角色。該脂質(zhì)分子非極性尾部插入疏水孔中，極性頭部則位于口袋的細(xì)胞外側(cè)。
圖2 GPR88的變構(gòu)結(jié)合口袋
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
GPR88的變構(gòu)位點(diǎn)由TM5、TM6的細(xì)胞質(zhì)末端和Gi1的α5螺旋C末端組成，該變構(gòu)位點(diǎn)未在其他GPCR結(jié)構(gòu)中報(bào)導(dǎo)過(guò)。結(jié)合在該口袋的2-PCCA的中心酰胺有三個(gè)取代基，分別為氨烷基（aminoalkyl，R1），吡啶基環(huán)丙基（pyridylcyclopropyl，R2）和聯(lián)芳基（biaryl，R3）。其中R2插入了口袋，芳環(huán)中的鄰位氮與甘氨酸的主鏈 NH 形成氫鍵；R1、R3和TM5、TM6面向膜的表面疏水氨基酸（包括纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和半胱氨酸）形成了廣泛的疏水相互作用。研究者還觀(guān)察到三個(gè)假定的膽固醇分子和TM5、TM6一起形成了和正構(gòu)位點(diǎn)相似的疏水孔，進(jìn)一步增強(qiáng)了2-PCCA在變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合。構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果證明：配體R2基團(tuán)的吡啶和變構(gòu)口袋表面亮氨酸、纈氨酸（疏水氨基酸）對(duì)2-PCCA結(jié)合變構(gòu)位點(diǎn)并激活受體非常重要。
GPR88的活性構(gòu)象和視紫紅質(zhì)（rhodopsin）等其他A類(lèi)GPCR有所不同。首先，GPR88較短的跨膜螺旋、更靠?jī)?nèi)的TM6，使得TM5和TM6細(xì)胞質(zhì)末端界面形成空腔，即變構(gòu)位點(diǎn)。其次，序列對(duì)比表明GPR88的ECL上缺少半胱氨酸，進(jìn)而缺少二硫鍵的形成，導(dǎo)致GPR88的ECL更加動(dòng)態(tài)。另外，GPR88缺少A類(lèi)GPCR保守的撥動(dòng)開(kāi)關(guān)W6.48和P5.50-I/L3.40-F6.44基序。撥動(dòng)開(kāi)關(guān)W6.48在其他視紫紅質(zhì)家族的GPCR激活中觸發(fā)TM6向外移動(dòng)，GPR88中該位點(diǎn)則被蘇氨酸代替。P-I/L-F基序的空間重排在從細(xì)胞外域到G蛋白耦合界面構(gòu)象變化的傳播中起關(guān)鍵作用，然而在GPR88中，P5.50被Q2045.50所取代并和L1283.40、F6.44相互作用（即Q-L-F基序）；同時(shí)，L1283.40位于未確認(rèn)的電子密度下方并可能和假定的內(nèi)源性配體有直接接觸。將Q2045.50突變?yōu)楦彼幔≒）增強(qiáng)了2-PCCA對(duì)GPR88的活性，證明在信號(hào)傳導(dǎo)上，更典型的P-L-F基序比GPR88的Q-L-F基序可能更加有效（圖3）。
圖3 序列比對(duì)，Q2045.50和H1313.43的突變實(shí)驗(yàn)
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
TM7中的N7.49P7.50xxY7.53基序是另一個(gè)在A(yíng)類(lèi)GPCR中保守的序列。在活性視紫紅質(zhì)和μ阿片受體（μO(píng)R）中，Y7.53和N7.49和TM3及TM5通過(guò)水形成極性網(wǎng)絡(luò)相互作用，其中的氫鍵涉及骨架羰基[11, 12]。在GPR88中，親水氨基酸組氨酸（H1313.43）直接和Y3367.53形成氫鍵。值得注意的是，研究者觀(guān)察到位于Y3367.53和H1313.43界面上兩個(gè)水分子的電子密度（圖4）。上方的水分子進(jìn)一步增強(qiáng)了N7.49P7.50xxY7.53基序和TM3之間的極性相互作用；下方的水分子則介導(dǎo)了與視紫紅質(zhì)和μ阿片受體中相似的，Y3367.53、H1313.43和Y2125.58之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。
圖4 水介導(dǎo)的極性網(wǎng)絡(luò)
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
研究者此后又進(jìn)行了從活性狀態(tài)到非活性狀態(tài)（通過(guò)刪除2-PCCA、Gi1和scFv16）的元?jiǎng)恿W(xué)模擬（metadynamics simulations），結(jié)果和觀(guān)察到的結(jié)構(gòu)特征相符：撥動(dòng)開(kāi)關(guān)T6.48的2.2 ?位移；Q5.50-L3.40-F6.44基序的大型結(jié)構(gòu)重排；水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了重新排列：H1313.43下方的水分子從受體核心移位，導(dǎo)致N7.49P7.50xxY7.53的構(gòu)象變化；上方的水分子仍然存在，介導(dǎo)TM3和TM7之間的一個(gè)小極性網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，H1313.43在未被激活時(shí)也參與了該極性網(wǎng)絡(luò)，表明了其在穩(wěn)定GPR88的非活性構(gòu)象中的潛在作用。值得注意的是，受體失活重塑了變構(gòu)位點(diǎn)。結(jié)果是在模擬中，TM6的向內(nèi)運(yùn)動(dòng)縮小了變構(gòu)位點(diǎn)的疏水袋，阻止了2-PCCA的結(jié)合（圖5）。
圖5非活性狀態(tài)GPR88的元?jiǎng)恿W(xué)模擬
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
結(jié)合或不結(jié)合2-PCCA的結(jié)構(gòu)在G蛋白耦合界面幾乎相同，在2-PCCA結(jié)合結(jié)構(gòu)中G蛋白的略微向上移動(dòng)。與先前報(bào)道的復(fù)合物結(jié)構(gòu)相似，α5螺旋的C末端插入由TM3和TM5-7的細(xì)胞質(zhì)末端形成的空腔中。該空腔中，α5螺旋和TM3、TM5和TM6上的疏水氨基酸通過(guò)疏水接觸相互作用，同時(shí)α5螺旋半胱氨酸的骨架羰基和TM3的精氨酸之間形成了氫鍵。值得注意的是，變構(gòu)2-PCCA還通過(guò)與GPR88的TM5-TM6、Gi1的α5螺旋參與疏水網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步穩(wěn)定GPR88-Gi1信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物的界面并且導(dǎo)致Gi1的輕微移動(dòng)。
除了疏水接觸外，TM5的細(xì)胞質(zhì)末端和α5螺旋的底部之間存在極性相互作用， GPR88的ICL2和Gi1的αN螺旋之間也存在一個(gè)極性界面，主要涉及氫鍵的形成。這些極性相互作用對(duì)于GPR88和Gi1之間的耦合可能至關(guān)重要（圖6）。
圖6 GPR88和Gi1的耦合界面
（圖源：Chen G, et al., Nat Commun, 2022）
綜上所述，該研究展示了結(jié)合或不結(jié)合合成激動(dòng)劑（2-PCCA）的GPR88-Gi1信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)在GPR88的規(guī)范正構(gòu)袋中揭示了相似的電子密度，該密度可能代表受體的假定內(nèi)源配體。2-PCCA是一種變構(gòu)激動(dòng)劑，與變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，直接涉及與G蛋白的相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，從而促進(jìn)了GPCR88的高活性。Apo-GPR88-Gi和2-PCCA-GPR88-Gi的高分辨率結(jié)構(gòu)對(duì)比表明，正構(gòu)袋中的假定內(nèi)源配體可以與GPR88共純化。此外，未確定的密度和正位口袋的特性表明GPR88可能是響應(yīng)某些生物活性脂質(zhì)的受體。令人感興趣的是，與其內(nèi)源性激動(dòng)劑S1P結(jié)合的鞘氨醇1-磷酸（S1P）受體的最新結(jié)構(gòu)顯示出與GPR88相似的正位結(jié)合口袋，口袋中形成了用于結(jié)合S1P的穿透性長(zhǎng)隧道[13]。因此研究者推測(cè)，GPR88的內(nèi)源性激動(dòng)劑可能是一種與S1P相似的脂質(zhì)分子，并且該脂質(zhì)配體可能能夠與GPR88的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合以調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。但是，作者不能排除脂質(zhì)分子具有分支結(jié)構(gòu)和未確定的電子密度由靈活區(qū)形成的可能性。
該研究還揭示了一個(gè)廣泛的由水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)連接了受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和G蛋白，穩(wěn)定GPR88的活性構(gòu)象。GPR88跨膜核心區(qū)的不保守殘基H1313.43不僅在介導(dǎo)極網(wǎng)絡(luò)中扮演著關(guān)鍵作用，而且還是維持GPR88的功能表達(dá)的關(guān)鍵，這揭示此孤兒受體中獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)比較活性cryo-EM結(jié)構(gòu)與元?jiǎng)恿W(xué)生成的GPR88的去活化模型，該研究揭示了與GPR88激活相關(guān)的關(guān)鍵構(gòu)象變化。
總而言之，該研究提供了理解孤兒受體GPR88的配體結(jié)合，激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)GPR88的“脫孤”?；诮Y(jié)構(gòu)的激動(dòng)劑、拮抗劑設(shè)計(jì)可能會(huì)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供有價(jià)值的候選藥物。
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第一作者簡(jiǎn)介
陳耕 博士
香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院/科比爾卡創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)研究院助理研究員，鵬城孔雀計(jì)劃特聘崗位。博士畢業(yè)于Baylor University，并在UT Austin從事博士后研究工作，現(xiàn)從事GPCR藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)研究和藥物開(kāi)發(fā)。
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杜洋 教授
醫(yī)學(xué)院助理院長(zhǎng)（科研與創(chuàng)新）
香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院助理院長(zhǎng)（科研與創(chuàng)新）、科比爾卡創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)研究院研究員，博士生導(dǎo)師，教育部青年，廣東省珠江青年拔尖人才。師從諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Brian Kobilka教授從事GPCR相關(guān)的博士后研究工作，回國(guó)前獲得密歇根大學(xué)安娜堡醫(yī)學(xué)院tenure-track助理教授職位等。迄今已發(fā)表約60篇高質(zhì)量SCI論文，包括以第一或通訊作者（含共同）在Cell、Sci. Adv.、JACS、Nature Comm.、Cell Res.等國(guó)際一流期刊報(bào)道的科研和轉(zhuǎn)化成果。擬招聘博士后和學(xué)術(shù)型碩士/博士生，歡迎感興趣的同仁聯(lián)系交流（[email protected]）。
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